直接PCR（Direct PCR）是一種不經(jīng)核酸提取而直接使用動物或植物組織等直接進行擴增的反應(yīng)。在許多方面，直接PCR的工作方式類似于常規(guī)PCR。
主要區(qū)別是直接PCR中使用的定制緩沖液，樣本可不經(jīng)過核酸抽提，直接進行PCR反應(yīng)，但對于參與直接PCR反應(yīng)的酶的耐受性和buffer的兼容性有相對應(yīng)的要求。
盡管常見的樣品中或多或少都會存在PCR抑制劑，但在酶和buffer的作用下直接PCR仍可實現(xiàn)可靠的擴增。而傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)需要以高質(zhì)量的核酸為模板進行反應(yīng)，如模板中含有蛋白以及其他雜質(zhì)時就會抑制PCR反應(yīng)的順利進行。直接PCR是目前分子診斷領(lǐng)域比較熱門的技術(shù)之一。
01
直接PCR最初用于動植物
直接PCR最早應(yīng)用的領(lǐng)域是動植物領(lǐng)域，比如鼠、貓、雞、兔、羊、牛等動物的血液、組織和毛發(fā)；植物的葉片和種子等，用來研究基因分型、轉(zhuǎn)基因、質(zhì)粒檢測、基因敲除分析、DNA來源鑒定、物種鑒定、SNP分析等領(lǐng)域。
這些領(lǐng)域有一些共同的特點，那就是目標(biāo)基因的含量比較高，核酸提取麻煩，所以直接PCR不僅能夠節(jié)省時間，對結(jié)果的影響很小，同時也能節(jié)省成本。
直接PCR用于病原體檢測，是近幾年的事，部分PCR試劑廠商在做創(chuàng)新的時候朝著這個方向做了很多的努力，尤其是這次新冠疫情，市場上出現(xiàn)了很多這樣的檢測產(chǎn)品！
02
直接PCR需要的試劑
樣本裂解液
樣本裂解液可以自己配置，也可以購置。不同品牌裂解液組份的差異會使得裂解能力各有不同，進而裂解時間稍有差異。比如說動物組織樣本制備，一般推薦30min或過夜裂解，針對病毒類的裂解液在3-10min不等。
PCR master mix
建議使用熱啟動DNA聚合酶，增強特異性擴增，擴增能力也更強。直接PCR的核心就是具有高度耐受的聚合酶。
清除或抑制樣本中影響DNA擴增的組份
樣本在經(jīng)過裂解液處理之后，會釋放出蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他細(xì)胞碎片，這些物質(zhì)會抑制PCR反應(yīng)，因此直接PCR需要加入相應(yīng)的清除或者抑制劑來減弱這部分因素的影響。
03
直接PCR五大知識點薈萃
第一、Direct PCR技術(shù)是針對各類生物樣品的直接PCR技術(shù)。該技術(shù)條件下，無需對核酸進行分離提取，直接以組織樣本為對象，加入目標(biāo)基因引物進行PCR反應(yīng)。
第二、Direct PCR技術(shù)不僅僅是傳統(tǒng)的DNA模版的擴增技術(shù)，也包含RNA模版的逆轉(zhuǎn)錄PCR。
第三、Direct PCR技術(shù)不僅僅是直接對組織樣本進行常規(guī)定性PCR反應(yīng)，還包括Real-Time qPCR反應(yīng)，這就要求反應(yīng)體系具備極強的抗背景熒光干擾能力以及對內(nèi)源性熒光淬滅劑的拮抗能力。
第四、Direct PCR技術(shù)針對的樣本，只需要核酸模版的釋放，并不對干擾PCR反應(yīng)的蛋白、多糖、鹽離子等進行去除，這要求反應(yīng)體系中的核酸聚合酶和PCR Mix具有極佳的抗逆性和適應(yīng)性，能夠在復(fù)雜的條件下保證酶活性和復(fù)制準(zhǔn)確性。
第五、Direct PCR技術(shù)針對的組織樣品未經(jīng)任何核酸富集處理，模版量極少，這就要求反應(yīng)體系有極高的靈敏度和擴增效率。
參考資料：翊圣生物、賽默飛生命科學(xué)等
本文文章來源：IVD從業(yè)者網(wǎng) 轉(zhuǎn)自搜狐網(wǎng)，不代表深藍(lán)醫(yī)療觀點，若有侵權(quán)，請及時聯(lián)系刪除。
